[摘要] 目的：探讨不同剂量伽玛（γ）射线影响人垂体瘤细胞细胞周期和抑癌基因p16表达的变化。方法：采用机械分离法获得稳定生长垂体瘤原代培养细胞株，根据不同照射剂量分为4组照射组，分别接受中心剂量为2、5、8.22、13.33 Gy，设立对照组，剂量为0，照射后用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率，Western Blot法检测p16蛋白的表达变化。结果：对照组和中心剂量2 Gy照射后细胞周期、凋亡率和c-myc蛋白表达无明显差异；中心剂量分别为5 Gy和8.22 Gy时细胞周期G0/G1和G2/M期细胞数量逐渐增多，细胞凋亡率升高，p16蛋白表达增多，与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；剂量为13.33 Gy时，S期细胞增多，p16蛋白表达减少。结论：一定剂量的伽玛射线能够改变细胞周期，促进垂体瘤细胞进入凋亡，抑癌基因p16在此过程中可能发挥促进垂体瘤细胞进入凋亡过程。

　　[关键词] 垂体瘤；γ射线；细胞周期；p16

　　[中图分类号] R739. 41 [文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）04（a）-032-03

　　Gamma-ray induced the change of human pituitary tumor cell cycle and the expression of tumor suppressor gene p16

　　CHEN Chunmei1，2，3, YANG Weizhong1，2，3, WANG Rui1，2，3, SHI Songsheng1，2，3, WANG Chunhua1，2，3, CHEN Jianle1，2，3

　　1.Department of Neurosurgery, Union Hospital of Fujian Medicine University, Fuzhou350001, China; 2.Department of gama knife center, Union Hospital of Fujian Medicine University, Fuzhou 350001, China; 3.Fujian Institute of Neurosurgery, Fuzhou 350001, China

　　[Abstract] Objective: To investigate the change of human pituitary tumor cell cycle and the p16 tumor suppressor gene expression after Gamma knife radiation. Methods: The primary pituitary tumor cells with stable growth were gained from a patient of pituitary tumor by mechanical separation, and were divided into 4 groups with the radiation center dose 2,5,8.22,13.33 Gy respectively. There was the control group without radiation. Flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis. The expression of p16 protein were detected by Western Blot. Results: There was no significant difference for cell cycle, apoptosis and the expression of c-myc protein between the control group and the irradiation group with 2 Gy of center dose. Compared with the control group, the cell number of G0/G1 and G2/M phases from the irradiation groups with 5 Gy and 8.22 Gy of center dose were gradually increased, as well as the apoptosis rate increased, and p16 protein expression were increased （P<0.05）。 There were the S phase cells increased and the expression of p16 protein decreased for the irradiation groups with 13.33 Gy of center dose. Conclusion: Pituitary tumor cells could be induced to the change of cell cycle and apoptosis under the appropriate gamma ray dose. p16 tumor suppressor gene may play in this process to promote the process of pituitary tumor cells into apoptosis.

　　[Key words] Pituitary tumor; Gamma-ray; Cell cycle; p16

　　垂体瘤为颅内常见的良性肿瘤，但复发率高，经蝶窦或开颅显微外科手术是主要治疗手段，但是位于鞍内的微腺瘤，以及尚未累及视神经或视交叉的小腺瘤以及无法耐受手术或恐惧手术的病例均是γ-刀治疗的适应证，是一种安全、有效的治疗方法，对于伽玛射线对垂体瘤的分子生物学机制目前仍未明确。本文从垂体瘤患者中获取垂体瘤标本在体外原代培养人垂体瘤细胞，探讨伽玛射线对人垂体瘤细胞细胞周期和抑癌基因p16表达的影响，为体内伽玛刀治疗人垂体瘤提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　兔抗人p16单克隆一抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自Promega公司（美国），Western blot试剂盒（LumiGLO System）购自美国KPL公司。伽玛刀为我院引进的深圳敖华研发OUR旋转式伽玛刀。

　　1.2 垂体瘤细胞株原代培养

　　选取2009年8月我科资料完整的1例垂体瘤标本，经病理证实为良性的垂体腺瘤，垂体瘤切除后经机械分离法分离垂体瘤细胞，成功获得稳定生长垂体瘤细胞株，在DMEM培养基（加10%胎牛血清）、5% CO2、37℃条件下培养，以第3代细胞作为实验对象。

　　1.3 伽玛刀照射垂体瘤细胞株和分组

　　取处于稳定生长期的垂体瘤细胞，常规消化细胞，移入离心管中，转速500 r/min，离心2 min，弃培养液，加入Hank's液，吹散细胞，以每管1.5 ml平均分入EP管中，共10管。

　　10份标本随机分成1组对照组和4组照射组，每组均有2份标本。照射组根据照射剂量分为照射1~4组，其中照射1组伽玛刀照射中心剂量2 Gy（周边剂量1.5 Gy），2~4组以及对照组的照射中心剂量和周边剂量分别为5 Gy（3.75 Gy）、8.22 Gy（6.0 Gy）、13.33 Gy（10 Gy）和0（0）。

　　所有标本先在头部MRI（3.0）定位后置于旋转伽玛刀治疗机上照射，照射野为直径4 mm的球体，照射方式为等中心照射，照射深一个射点。照射完毕后部分细胞悬液离心，加入培养液，常规培养48 h，每组2份标本分别进行下一步实验。

　　1.4 流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡率

　　随机取各组1份标本，消化，离心，弃上清，PBS洗1次，离心，弃上清，用70%冷乙醇固定24 h后用PBS清洗，除去乙醇，加入Rnase（0.5 mg/管），37℃，30 min，冷却，PI染色15 min，暗室放置，应用FACS-scan 440型流式细胞仪， 激发波长为488 nm，发射波长为585 nm，测定前以鸡血红细胞为标准样品，调整仪器变异系数（CV）值<5%，测定DNA含量，独立重复5次实验，根据DNA分布的直方图，用多项式拟合法计数细胞周期各时相的百分比。同时，采用DNA细胞周期分析程序，计算凋亡细胞DNA断裂百分率。

　　1.5 Western Blot法检测p16蛋白在各组表达特点

　　取各组1份标本，放入预冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干称重，以重量（g）/体积（ml）=1∶9 加入预冷的组织蛋白提取液，用玻璃匀浆器研磨成组织匀浆，低温离心机4℃ 15 000 r/min，离心15 min。收集上清，以考马斯亮蓝法进行蛋白定量，经10% SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜后的硝酸纤维素膜经漂洗后用5%脱脂奶粉阻断非特异性结合，以封闭液分别稀释兔抗人p16单克隆一抗体（1∶1 000），按每cm2膜加入 0.1 ml 相应的每一抗体溶液，封膜机封口，4℃过夜，然后分别放入用封闭液按1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，最后在暗室中进行化学发光法显影。高敏感胶片（Sigma）摄片、洗片。蛋白带测定光密度（OD）值，β-actin作为内参照。

　　1.6 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计软件处理，各组标本检测值均以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验进行统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 FCM检测伽玛刀射线对垂体瘤细胞周期和凋亡率的影响

　　FCM检测结果显示，照射1组中心剂量2 Gy对细胞周期和细胞凋亡率影响不明显，而照射2组和照射3组中心剂量分别为5 Gy和8.22 Gy时，G0/G1期和G2/M期细胞随剂量增多比例升高，细胞凋亡率升高，而Ｓ期细胞逐渐减少，与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），当中心照射剂量达13.33 Gy时，S期细胞明显增多，细胞凋亡率下降，见表1。

　　表1 不同照射剂量作用垂体瘤细胞周期、细胞凋亡率

　　和c-myc蛋白表达的变化（x±s）

　　注：与对照组比较，*P<0.05

　　2.2 不同照射剂量作用下垂体瘤抑癌基因p16蛋白的表达比较

　　不同伽玛刀照射中心剂量作用下垂体瘤细胞中p16蛋白表达不一致，在对照组和照射1组表达量无明显改变，照射2组和3组中随剂量增加，表达量升高，与对照组差异均有统计学意义（P<0.05），照射4组中p16蛋白表达量下降。

　　3 讨论

　　细胞周期通常是指从通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程[1]。连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，包含G1期、S期、G2期、M期四个阶段[2]。正常细胞DNA在受到放射线和化疗药物损伤后，将启动细胞周期检测点，使细胞停滞于G1期、S期、G2/M期各个细胞周期检测点，进行损伤后修复[3]。肿瘤的放疗可以改变细胞周期，电离辐射可改变细胞周期的进程[4]。细胞周期阻滞是辐射引起的重要生物学改变。在正常细胞有丝分裂周期中存在G1/S期和G2/M期两个限制点，严格控制着细胞有丝分裂的启动和完成。当辐射等因素损伤细胞基因时，两个限制点可以分别通过延迟G1期和（或）G2期，保证细胞能够完成复制前和有丝分裂前的基因修复，当基因损伤超过细胞修复能力时，限制点则促进细胞的凋亡，从而确保高度忠实于亲代的细胞复制[5]。

　　本实验发现当伽玛刀照射中心剂量在2 Gy时，人垂体瘤细胞各细胞周期比例并没有明显变化，但是当剂量在5 Gy和8.22 Gy时，G0/G1期和G2/M期细胞比例增多，尤其是发生G1期阻滞现象，随着射线剂量增多，G2期阻滞现象明显，细胞凋亡率升高。当中心剂量为13.33 Gy时，出现Ｓ期细胞增多，且细胞凋亡率下降，细胞凋亡率下降可能与照射剂量过大导致大量细胞坏死，凋亡细胞比例下降有关。Kalassen[6]认为凋亡是一个需要基因表达，蛋白质合成和能量的主动过程，触发凋亡剂量远远低于造成坏死所需的剂量，照射剂量超过10 Gy足以破坏基因转录或细胞内外离子平衡，因而凋亡程序不能启动。本实验照射中心剂量>13.3 Gy组垂体瘤细胞凋亡率出现下降，同样说明单次照射剂量>10 Gy已达到垂体瘤细胞致死剂量，而照射剂量在5 ~10 Gy之间则可引起细胞凋亡，照射剂量<5 Gy则不能启动凋亡的发生。

　　p16基因又叫多肿瘤抑制基因（multiple tumor suppressor, MTS）是近年发现的直接参与细胞生长增殖负调控的抑癌基因[7]。目前认为，p16基因是对细胞周期影响最大的抑癌基因，直接作用于细胞周期的抑癌基因，是G1期重要的调控因子，具有阻止损伤的DNA进行修复、促进细胞凋亡的功能[8]。Machiavelli-Rea等[9]学者发现p16基因参与垂体瘤生长过程。Jaffarain等[10]对31例垂体瘤p16基因多态性进行了研究，发现垂体瘤中p16基因5’CpG岛甲基化率高达83.3%。而在正常垂体组织中均无p16基因甲基化现象，提示p16基因甲基化失活对垂体瘤的发生起重要作用。

　　本实验发现中心剂量在5 Gy和8.22 Gy时，p16蛋白随着照射剂量增加表达量升高，细胞凋亡率也随之升高，当中心剂量达到13.33 Gy，细胞出现坏死，p16蛋白表达量下降，G0/G1期和G2/M期细胞比例增多，尤其G0/G1期细胞明显增多，发挥G1期阻滞现象，随着射线剂量增多，G1期阻滞现象明显，细胞凋亡率升高。当中心剂量为13.33 Gy时，细胞凋亡率下降，出现Ｓ期细胞增多，主要是因为射线剂量太大，细胞周期中表现为S期细胞增多，凋亡率反而下降[6]。本实验结果显示，一定照射剂量作用下，垂体瘤细胞中p16蛋白表达升高，与伽玛射线激化有关，使肿瘤细胞不能完成全部细胞周期，增殖被抑制，肿瘤细胞发生凋亡，发挥抑制垂体瘤细胞生长增殖的作用。

　　[参考文献]

　　www.17net.net论文发表

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　　[8]Liang X, Wang P, Gao Q, et al. Endogenous LKB1 knockdown accelerates G（1）/S transition through p53 and p16 pathways [J]. Cancer Biol Ther,2010,9（2）：156-160.

　　[9]Machiavelli G, Cotignola J, Danilowicz K. Expression of p16（INK4A） gene in human pituitary tumours [J]. Pituitary,2008,11（1）：71-75.

　　[10]Jaffrain-Rea ML, Ferretti E, Toniato E, et al. p16 （INK4a, MTS-1） gene polymorphism and methylation status in human pituitary tumours [J]. Clin Endocrinol （Oxf），1999,51（3）：317-325.